抗生素发酵生产中染菌的主要原因分析与预防控制措施

生产抗生素通常采用微生物纯种培养，培养过程中只允许特定的微生物生长，如果发酵过程中除抗生素产生菌以外还有其他微生物存在(染菌)，就会影响抗生素产量和质量。抗生素发酵在生产中常常因操作环节复杂而更容易染菌，本文将结合长期生产实践中积累的一些经验，对避免发酵染菌给出对应的预防措施。

1、摇瓶(斜面)种子带菌导致一级种子罐染菌

摇瓶(斜面)种子制备过程中，如果存在母瓶(母斜面)培养基和子瓶(子斜面)培养基灭菌不彻底或菌种操作人员在净化工作台中进行母瓶(母斜面)，子瓶(子斜面)接种及并瓶时无菌操作不规范或摇瓶种子培养环境不洁净等现象就会造成摇瓶(斜面)种子带菌而导致一级种子罐染菌。

预防方法:

菌种制备过程中首先要保证配制的培养基没有较大颗粒，培养基灭菌时要保证蒸汽流动,做到压力计和温度计的准确致性，防止假压形成。为防止灭菌后培养基二次染菌，应尽量做到培养基即灭菌即使用。无菌操作时保证无菌室在使用前彻底灭菌，所用器具不带菌。操作时无菌物品在上风处，带菌(或可能带菌)物品在卜风处;操作人员少说话，避免咳嗽、打喷嚏及其他大幅度动作。

无菌室管理按照GMP有关洁净区的要求进行，定期检测沉降菌、浮游菌

摇瓶间按洁净区管理。摇瓶间是摇瓶种子母瓶、子瓶培养的场所在培养过程中瓶塞上往往会附着尘埃。在接种、并瓶等无菌操作过程中拔瓶塞时灰尘很容易落进瓶内，造成种子带菌。要想实现摇瓶种子无杂菌，保持摇瓶间的清洁是非常关键的。应当把摇瓶间当做洁净区区进行管理:每日坚持用干净湿抹布拭摇瓶间的地而及墙而:在充分消除对培养种子影响的情况不定期用消毒液如双氧水等对摇瓶间进行消毒。

2、一级种子管接种操作不当染菌

火焰接种会导致一级种子罐染菌种子罐接种时，除按要求进行室内消毒外，还需要消毒人员与接种人员密切配合快、准、稳地完成操作过程，否则易导致接种失败。

预防方法:

进行一级种子罐接种:一是压差接种法，二是零磅接种法。当采用零磅法接种时，罐压瞬时为零，外界空气就有可能从设备的泄漏处(如轴封等)及接种口进入罐内造成染菌。因此，保持一级罐接种区的洁净度也是减少染菌的有效方法，应当做到:一级种子罐要有单独的区域同其他生产区隔离;保持一级种子罐区的环境卫生，一级种子罐区门窗日常应处于密闭状态，每次接种前用消毒液喷雾消毒;环境定期用高锰酸钾熏蒸消毒。

有些公司将一级种子罐的接种口放置在无菌室内的净化工作台前，效果良好

3、蒸汽质量造成的染菌

由于受各方面因素影响，蒸汽质量波动很大。有时蒸汽中冷凝水含量很高，总蒸汽压力较低，并且压力波动很大，温度低，这种蒸汽属于湿饱和蒸汽，灭菌效果较差，很容易造成染菌。

预防方法:

在生产进度允许的情况下，可采取空消的办法，排除蒸汽中的一部分冷凝水，待蒸汽相对干燥一些后，再正式进罐消毒灭菌。

也可以在进罐灭菌之前，开启各个蒸汽灌录上的冷凝水阀门排冷凝水，待蒸汽中含水量减少之后再进罐。

以上只是应急措施，要从根本上解决蒸汽中冷凝水的问题，还必须从蒸汽锅炉的设计容量、系统管路的合理安装、管道的保温等方面去解决。需要特别注意的是消毒蒸汽管路不能连接非消毒设施，如采暖设备，职工澡塘的蒸汽，否则会造成发酵车间蒸汽压力下降和波动，甚至有菌物料和蒸汽的串连，因这种原因造成的染菌在很多厂家都发生过。

4、空气系统引起的染菌

过滤器失效会导致染菌因空气系统带菌而导致罐染菌的机率较高。空气系统容易出现的问题是:无菌空气带油带水。空气过滤器质量和高效滤芯的安装质量等几个方面。无菌空气中带油多来自往复式空气压缩机上，解决这个问题，首先应从采用无油润滑空压机着手。无菌空气带水，主要是由压缩后的高温空气，经突然冷却后产生的。除水设备泄漏、设计不合理或是失效是空气带水的主要原因。

预防方法:

增加必要的除油除水设备。特别要注意定期排水，尤其是湿度大的阴雨天气,

采用无油润滑的空压机，从根本上解决。若无法改造，可以在总空气过滤器上填充活性炭或玻璃棉减少油雾阻力。

空气过滤器滤芯要采用质量较好的厂家的产品。

使用尘埃粒子计数器等检测仪器和生物鉴定方法对过滤器是否失效进行准确、及时的判断

安装高效过滤器要注意以下几点:高效过滤器的灭菌管路，一定要经过减压、温压、粗滤处理;高效过滤器的空气进出口管路上安装监测口;安装前一定要仔细检査卡口与O形圈的配合尺寸;一般一个季度做一次检查;发酵过程中染菌后要根据菌型判断杂菌的来源，不能草率的拆卸高效过滤器。

5、降温设备泄漏和堵塞

发酵罐夹层和蛇形管的穿孔是造成染菌的主要原因之一。

冷水阀门内漏、夹套(蛇管)排水阀门堵塞也是造成染菌的主要设备因素。

预防方法：

在冷却设备制作过程中，应当选用不锈钢材质未原料进行冷却设备的加工制造，冷却设备制造结束，应当进行严格个试漏检查，并应当进行射线探伤检查并拍片。发酵车间应当建立冷却设备的定期检查及试压、试漏制度发酵罐必须每批下罐进行罐内设备的检查，防止蛇形管定位卡松动而造成穿孔泄漏。

6、培养基带菌导致罐染菌

培养基颗粒过大会导致灭菌不彻底，培养基灭菌操作不到位导致灭菌不彻底培养基在灭菌过程中，对预热时间、蒸汽阀门的开度、灭菌温度、灭菌压力和泡沫控制等，都有严格要求，一个环节出现问题，就容易导致染菌。

预防方法：

培养基配制时应充分搅拌，并在输料管道上安装管道过滤器，以防止大颗粒固形物进入种子罐造成培养基灭菌不彻底。若种子罐较小，配料量较小的情况下，最好将原料过，可有效防止此种情况。

灭菌前全面检查设备、消除灭菌死角，根据设备大小决定灭菌预热时间；培养基灭菌时其蒸汽压力不得低于0.3 MPa，根据培养基初始温度的不同决定阀门的开启程度。灭菌过程中应保证与培养基相接触的管道大进蒸汽，与培养基不接触的管道小进蒸汽；防止出现假压，要同时观察压力表和温度表，二者应符合对应关系，如有明显差异，可根据经验判断失灵者（一般以温度计为准）。灭菌过程中进汽阀门应逐渐增大，排汽阀门应逐渐关小；保压灭菌时应保证压力温度稳定。

有效解决发酵空气系统带菌造成的染菌问题，对去除发酵杂菌污染、酵母菌污染、耐药菌污染、噬菌体污染、支原体污染等有着全套的解决方案，可替代甲醛、二氧化氯等消毒剂进行杀菌抑菌。