药明生物详解微生物发酵技术：从菌株工程到复杂生物药规模化生产

近日，药明生物副总裁、微生物产业化平台负责人张胜博士（Sam Zhang）在国际行业媒体American Pharmaceutical Review发表署名文章，系统阐述了微生物发酵技术在复杂生物药研发与规模化生产中的关键价值与实践路径。文章从菌株工程、工艺开发、下游纯化及GMP放大等多个维度，深入探讨了面向复杂分子的微生物表达技术体系，并结合具体案例，展示了工程化宿主系统与系统化工艺设计在提升产品质量、一致性与生产效率方面的实践价值。

微生物发酵在多种生物药生产中发挥着不可或缺的作用，广泛应用于多肽、细胞因子、新一代治疗性酶等重组蛋白的制备。目前，全球已上市的重组蛋白治疗性药物中，约有三分之一采用大肠杆菌等微生物作为生产宿主。

该技术通过在受控条件下培养工程化微生物，诱导其稳定表达并合成目标分子，因工艺成熟、成本相对可控、生产周期较短、遗传背景清晰等优势，长期以来被广泛应用。

不过，在实际工艺开发过程中，微生物发酵也面临诸多技术挑战，例如遗传与表达稳定性不足、渗漏表达带来的工艺波动、毒性副产物的积累，以及翻译后修饰（PTM）不理想、包涵体形成和中间体稳定性不足等问题。这些因素往往直接影响最终产品的产量、一致性与质量控制。

随着抗体偶联药物、细胞治疗等先进疗法的加速发展，生物发酵技术正进入新的应用阶段。为应对复杂分子带来的工艺挑战，生物制药行业不断引入和整合前沿技术手段，持续提升发酵过程的稳定性与成功率。在这一过程中，微生物发酵的潜力正被不断释放，成为支撑创新生物药生产的重要基础，广泛应用于纳米抗体、酶、细胞因子、生长激素、病毒样颗粒（VLP）等分子类型，以及其他具有更高复杂度的生物大分子。

面向复杂分子的菌株工程：提升表达稳定性与产量上限

微生物表达系统是生物药生产中极具优势的平台，但传统的大肠杆菌菌株往往难以全面满足复杂项目的需求。例如，调控能力不足时，容易出现有毒或高表达负担型蛋白的渗漏表达；而过高水平的有毒蛋白表达，则可能抑制菌体生长并影响工艺稳定性。此外，实际生产中还常面临目标蛋白表达量偏低、非预期翻译后修饰导致产品纯度下降，以及发酵过程中质粒稳定性不足等挑战，这些因素都会对最终产量与质量造成不利影响。

为应对上述问题，工程化的大肠杆菌表达系统被广泛用于表达载体构建优化、序列与密码子优化、信号肽筛选以及快速菌株开发等关键环节。通过重构代谢途径并减少对质粒的依赖，可显著提升菌株稳定性与产量，实现更加高效且一致的蛋白表达；同时，结合密码子优化与载体工程改造，使密码子使用偏好与表达载体更好地适配目标蛋白，从而提高整体翻译效率。

在此基础上，配合先进的菌株开发策略，可构建全新的专有工程化大肠杆菌菌株，有效解决遗传与表达不稳定、渗漏表达、有毒副产物生成以及翻译后修饰不理想等问题，最终实现对产品产量和质量的系统性提升。

EffiX™：工程化宿主系统的设计

药明生物自主研发的EffiX™大肠杆菌表达系统已验证了这一技术路径的可行性。该系统通过优化质粒复制机制，在无需添加抗生素的条件下，实现质粒稳定传代不少于120代，兼顾稳定生产与环境可持续性；同时，目标蛋白表达过程稳定，质粒保留率可达100%（图 1A）。

作为质粒表达的替代方案，基因组整合表达方式进一步提升了系统稳定性，其表达水平可与质粒表达相当。将多种策略组合应用，还可实现多组分共表达，支持非天然氨基酸掺入等复杂重组蛋白体系的构建。

EffiX™大肠杆菌表达系统还可有效解决渗漏表达问题，

这一问题正是传统BL21 (DE3)-pET 表达体系中长期存在的关键技术痛点。通过对宿主系统中质粒的工程化设计与调控优化，该系统能够在诱导表达前对靶基因转录实现高度可控的抑制。研究结果表明，经该策略改造后的工程菌株在诱导阶段可保持更优的生长状态，从而显著提升蛋白表达效率，目标分子的产量提高2至5倍（图1B）。

图 1. 药明生物新型专有大肠杆菌系统EffiX™，优化了质粒复制，可在120次倍增后仍维持稳定表达，同时解决了渗漏表达的问题

研究进一步表明，EffiX™设计的大肠杆菌表达系统可有效消除非预期的翻译后修饰。通过对宿主菌株进行系统性遗传工程改造，该表达系统能够从源头规避不理想翻译后修饰的产生。相较于传统BL21 (DE3)-pET表达体系中目标蛋白常伴随下游纯化难以彻底去除的翻译后修饰变体，EffiX™系统可实现对含非预期翻译后修饰产物的完全剔除，显著提升最终产品的纯度与一致性。

另一常见挑战为前噬菌体风险，即溶源性噬菌体从大肠杆菌基因组中被重新激活，而T1/T5噬菌体感染会直接导致细胞裂解，造成蛋白表达量显著下降。EffiX™系统通过移除宿主菌株中的噬菌体受体，可从根本上消除菌株对T1/T5噬菌体的易感性。相较于传统BL21 (DE3)-pET系统，新型EffiX™系统在规模化生产中优势显著，可大幅降低因防控噬菌体污染所耗费的时间、物料及人力成本。

针对特殊分子类型的定制化表达策略：VHH的案例解析

宿主系统的遗传工程改造同样为VHH（重链抗体可变区，即纳米抗体） 的高效生产提供了可行路径。VHH具有分子量小、溶解性好、热稳定性优异等优势，但其高度保守的二硫键结构，使其在大肠杆菌胞内表达时容易形成包涵体，限制了表达效率和可放大性。

针对这一挑战，我们构建了新型大肠杆菌表达系统，并对诱导过程中的关键工艺参数——包括诱导生物量浓度、诱导剂浓度、补料速率和培养温度等——进行了系统评估与优化。在此基础上，成功建立了一种显著增强蛋白转运与分泌能力的两阶段高细胞密度发酵工艺。

研究结果表明，该策略可使VHH的表达量提升约12倍，整体产率提高约5倍（图 2），显著改善了VHH在微生物体系中的生产效率与工艺可行性。

图2 相较于对照工艺，EffiX™可使VHH表达量提升12倍，分泌型VHH产率提升5倍

生物工艺优化的系统方法：DoE、PAT与工艺建模的协同应用

在上游生物工艺开发中，常见挑战包括蛋白表达量偏低、易形成包涵体，以及脱酰胺、氧化、水解、剪切、乙酰化、甲酰化、二硫键错配和非酶促糖基化等非预期翻译后修饰。这些问题可能对重组蛋白的产量、纯度、结构和功能产生不利影响。

生物工艺优化的核心在于实验设计（Design of Experiments, DoE）。通过DoE，可在发酵工艺开发阶段探索诱导温度、pH 值、菌体密度、补料策略等关键参数的设计空间 进行系统性考察，高效探索其设计空间并识别关键工艺变量量。在此基础上，过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT） 作为质量源于设计（QbD）的重要组成部分，可用于实时监测关键工艺参数和变量，提升工艺过程的可控性与可理解性；而工艺建模则是支撑工艺优化与表征的核心工具，有助于揭示变量之间的内在关联，并增强对工艺行为的预测能力。通过将DoE、PAT与工艺建模相结合，能够系统识别并确定关键工艺参数的最优操作区间，从而建立稳健、可放大的生物工艺控制策略（图 3）。

图3 过程分析技术（PAT）是质量源于设计（QbD）的基石，而工艺建模则是工艺优化与表征的核心环节

从高通量筛选到GMP工艺路径：构建可放大的生产体系

通过多平行生物反应器中的高通量筛选，可完成关键参数的识别与验证。在此基础上，结合模型分析，评估其对工艺放大、生产效率及产品质量的预测能力，从而建立稳定、可放大的高密度细胞培养工艺，实现产量与质量的同步提升。

进一步而言，通过系统筛选最优工艺参数，在微型生物反应器中开展高通量验证，并对模型在放大条件下对产率和质量的适用性进行确认，可构建一套覆盖工艺开发直至原料药 GMP 生产的稳健工艺路径。与此同时，通过评估并筛选等效替代的耗材与试剂，还可在确保产品质量一致性的前提下，有效降低工艺运行和生产制造成本。

下游纯化策略的灵活构建：应对复杂分子与包涵体挑战

随着生物药分子形式日益多样化和复杂化，下游纯化所面临的挑战也在持续增加，常见问题包括产率偏低、残留杂质较高、中间体稳定性差以及包涵体复性效率低等。为此，药明生物构建了一套高度灵活的下游纯化技术体系，可精准适配细胞裂解、澄清、包涵体复性及层析纯化等关键单元操作。

以大肠杆菌表达的重组蛋白为例，其N端甲硫氨酸残基常存在异质性，在部分应用场景下可能影响生物活性，并对后续 N 端修饰或分子偶联等操作形成障碍。针对这一问题，可在目标蛋白 N 端引入 His‑SUMO 标签（图 4），有效提升难表达蛋白的可溶性，从而规避包涵体复性相关的工艺挑战。

在下游纯化阶段，通过固定化金属离子亲和层析（IMAC），可实现蛋白纯度高于 95%。随后，借助 SUMO 蛋白酶特异性切割去除 His‑SUMO 标签、并保证目标蛋白 N 端无氨基酸残基，并结合流穿模式 IMAC 进一步分离，再进一步精纯即可获得高纯度的无标签目标蛋白，为后续功能研究和产业化应用提供可靠保障。

图4 创新的His‑SUMO标签策略通过在蛋白N端引入标签，可有效降低N端甲硫氨酸残基的异质性，避免生物活性降低及N端修饰、偶联应用受限等问题

下游难点的针对性解决方案：溶解性、异质性与复性效率

在某些情况下，包涵体复性难以完全避免。复性条件对目标分子具有高度特异性，且正确折叠蛋白的收率往往偏低。传统的稀释复性方法通常需要处理大量中间液体。相比之下，柱上复性虽在工艺开发上更具挑战性，但能够显著提升下游处理效率，因而在复杂分子生产中展现出独特优势。为加速柱上复性条件的建立，我们基于专有缓冲液数据库开展高通量筛选，从而快速识别最优复性窗口并提升整体收率。

研究结果表明，

采用柱上复性策略可显著提高复性效率与最终总收率，为包涵体相关项目提供了一种更高效、可控的下游解决方案。

面向商业化的GMP放大生产：实现工艺一致性与规模适配

在小规模实验室条件下表现良好的菌株，在转入大规模发酵后可能出现不可预测的波动。此外，工业级生物反应器与摇瓶在混合方式上也存在显著差异，如氧气传递、传热速率、剪切力导致的细胞破碎、稀释复性效果等。因此，要在放大过程中保持工艺一致性，需要使用适应工业条件的菌株，这有时需要额外的微生物筛选或工程改造。

为了确保从实验室到GMP生产的成功放大以及批间一致性，我们开发了新型规模放大模型，系统整合氧传递速率、混合效率/均一性、传热系数及单位体积功率输入（P/V）等关键工程参数。这些模型通过全面的工艺表征和实时过程监控得到进一步验证（图5）。

图5 整合关键工程参数的稳健放大模型，可实现从实验室研发到GMP生产车间的无缝衔接

由于各类生物药市场需求的差异性，不同生物药物的临床/商业批次生产规模可能有所不同。为满足生产规模的动态需求，我们建立了一个灵活的微生物平台，该平台配置了各规模的生物反应器（30 L–15000 L生产规模），搭配相应的下游纯化生产线，可高效支持GMP生产。

持续释放微生物发酵平台在创新生物药中的价值

综上所述，通过系统性破解菌株层面的固有挑战，并结合智能化的生物工艺设计与开发，以及稳健、可控的 GMP 放大策略，生物制药企业能够充分发挥微生物表达系统的优势，在显著提升产品产量、纯度与质量的同时，实现更具经济性的生产模式。

依托现代生物技术的专业应用与灵活适配的 GMP 生产平台，微生物生产体系在适应性、可放大性、工艺重现性以及成本效率等方面展现出愈发突出的综合优势。这些持续演进的技术创新，正在不断释放微生物表达平台的潜力，为创新生物药的研发、转化与规模化生产提供坚实而可靠的支撑。

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