食源性抗氧化肽的制备、活性评价及细胞调控途径研究进展

今天与大家分享一篇食源性抗氧化肽的综述性文章，该文章于2022年发表在Trends in Food Science & Technology（IF= 15.3）上。

氧化应激是引起机体内细胞凋亡、组织损伤和病理改变的主要原因。服用抗氧化剂可以消除自由基，降低高血压、心血管疾病的发病率。食品源性抗氧化肽是通过酶水解可食用蛋白质制备的，由于其分子量小、抗氧化活性高、安全性强等特点，逐渐成为合成抗氧化剂的有效替代品。这篇文章从食品源性抗氧化肽的制备、活性评价、转运吸收以及抗氧化介导的功能活性等方面进行了详细的综述。此外，还强调了抗氧化肽的多种靶向调控途径，以阐明它们如何发挥其介导的功能活性。

1. 制备抗氧化活性肽

目前，从许多天然食物中分离到抗氧化肽，其来源包括谷物、植物种子、真菌、动物产品和水产品等。食源性抗氧化肽在其自然结构中的活性通常不强，因此，优化制备方法使其活性最大化一直是研究的热点。抗氧化肽的制备主要有三种方法：直接从生物体中分离和提取；利用酶或酸进行水解或发酵来降解食品中的蛋白质；利用化学反应或DNA重组方法人工合成抗氧化肽。酶解法由于其条件温和，副产物少，易于控制等优点，是目前应用最广泛的制备方法。目前，主要通过控制酶的类型，优化酶水解条件，来获得最佳的酶解得率和抗氧化肽活性。不同类型的蛋白酶（如碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶等）由于裂解位点不同，会直接影响抗氧化肽的大小、组成和氨基酸序列，进而影响其抗氧化活性。与单一酶相比，多酶水解可能会获得具有更高活性的肽，未来选择合适的多酶进行更有效的酶解可能成为一种趋势。

酶法制备的粗抗氧化肽大多是蛋白质、肽和氨基酸的混合物。根据其不同的理化性质，可采用超滤（UF）、凝胶过滤层析、反相高效液相色谱（RP-HPLC）等方法对其进行分离纯化，得到纯度更高、活性更强的抗氧化肽。Yu（2020）等人通过超滤、凝胶过滤色谱和RP-HPLC从细点圆趾蟹的酶解产物中纯化了抗氧化肽，最后采用反相高效液相色谱法分离得到7个化合物。此外，一些实验使用了高效液相色谱（HPLC）、强阳离子交换-固相萃取（SCX-SPE）、反相快速蛋白质液相色谱（RP-FPLC）和尺寸排阻色谱等。

2. 食源性抗氧化肽的活性评价与改良

脂质氧化降解、清除自由基、螯合金属、还原能力等方法均可用于评价食源性肽的体外抗氧化作用。其中，清除自由基和抑制脂质过氧化是最常用的方法。在测定抗氧化肽清除自由基能力的实验中，清除ABTS、DPPH、OH自由基的能力是最常用的测定指标。Yang（2020）从黑鲨皮中分离提取了抗氧化肽ATVY，并确定其具有较强的DPPH自由基清除活性（RSA）和ABTS-RSA，值分别为81.05%和62.25%。除自由基清除能力外，还可以通过脂质氧化降解和还原能力进一步确定其抗氧化活性。研究表明，铁还原抗氧化力（FRAP）值高的组分含有较多的疏水性氨基酸，具有较好的还原能力和清除自由基的能力。

加工方法会不同程度地影响抗氧化肽的活性，提高抗氧化肽活性的方法大致可分为三类：物理修饰、化学修饰和酶法修饰。酶改性的方法就是通过组合或单独使用合适的水解酶，优化抗氧化肽的水解条件。物理改性方法包括热处理、冷处理、电处理、磁场处理等。化学修饰需要改变多肽原有的结构，包括酸碱化、酰基化、脱酰胺化、磷酸化、糖基化等。糖基化也可称为美拉德反应，许多实验也证实美拉德反应能很好地提高食源性肽的抗氧化活性。

3. 食源性抗氧化肽的转运和吸收

能否在肠道内通过跨膜转运被吸收利用是抗氧化肽体内抗氧化功效的关键。研究发现，在跨膜电化学质子梯度的驱动下，二肽和三肽可以通过PepT1从肠细胞吸收到周围的毛细血管中。多肽的吸收途径还包括细胞旁途径（转运4-9个氨基酸残基）和跨细胞途径（转运脂溶性多肽）。具有10个以上氨基酸的生物活性肽通常通过非载体介导的内吞作用被肠道上皮细胞吸收。

4. 食源性抗氧化肽的作用机制

与体外化学方法相比，抗氧化肽的细胞保护作用更能反映食源性肽抵抗氧化应激的机制。一般而言，食源性肽的抗氧化活性归因于它们的多种能力（a）清除ROS，抑制细胞内抗氧化酶的产生;（b）调节内源性抗氧化酶的含量和活性;（c）调节氧化还原相关的信号通路。

在信号通路方面，近年来的研究主要集中在食源性肽通过抑制NF-κB通路来达到预期的抗氧化效果。NF-κB存在于细胞质中，在未受到刺激的细胞中，通常以异源二聚体（由p65和p50组成）的形式存在并与IκB相互作用，保持非活性状态。当细胞受到刺激因子如肿瘤坏死因子（TNF）或氧化应激刺激时，下游蛋白IκB便会被泛素化降解（图1）。研究表明米源肽AAGALPS能通过抑制IκBα、IKK和p65核转运的活化，调节NF-κB通路，减轻氧化应激的影响。薛氏海龙(S. schlegeli)肽QLGNLGV和SVMPVVA均能有效抑制H2O2诱导的人表皮成纤维细胞IκBα蛋白磷酸化，并进一步抑制p65蛋白进入细胞核，抑制NF-κB凋亡通路的激活，从而达到抗凋亡的效果。

Fig.1 NF-κB pathway in cells

Keap1-Nrf2-ARE通路是细胞抵抗氧化应激的关键途径。如图2所示，在正常生理条件下，Keap1和Nrf 2以非活性状态存在于细胞质中。Keap1蛋白会使Nrf 2蛋白泛素化并降解，从而保证体内游离的Nrf 2蛋白处于低水平。在胁迫条件下，Nrf2与Keap1分离，并启动ARE调控的一系列含有抗氧化和细胞保护基因（包括HO-1、SOD、GPx和CAT等）的转录。在启动子区域内表达，从而提高机体的抗氧化能力。目前许多研究集中在食物来源的抗氧化肽对Keap1-Nrf2-ARE通路的激活。研究表明大豆衍生肽可以激活Nrf2与ARE结合，从而有效上调抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）mRNA的表达。同时，Keap1的表达和Nrf2泛素化降低，进一步激活Nrf2通路。

Fig.2 Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway in cells

MAPK通路调节炎症、细胞增殖分化、凋亡、癌变、DNA损伤修复等生理活动，是与细胞生长关系最为密切的一条通路，因此与肿瘤的发生、发展有一定的关系。

Fig.3 MAPK signaling pathway in cells

目前，基于序列同源性和功能差异，已鉴定出四种不同的亚水平MAPK信号通路。它们是细胞外信号调节激酶1/2（ERK 1/2）、c-Jun N末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）和细胞外信号调节激酶5（ERK 5）（图3）。其中JNK和p38 MAPK的激活可介导信号转导导致细胞死亡，而ERK 1/2和ERK 5的激活可促进细胞存活。ERK 1/2激酶的亚水平通路是研究最多的核心MAPK通路。JNK通路大多与细胞应激和凋亡有关，与肿瘤的发生发展密切相关。生长因子、细胞因子和环境应激多种刺激信号可以介导JNK的活化。Qian等人（2021）使用HepG 2细胞验证海马肽对乙醇介导的细胞氧化应激的保护作用。海马肽可降低应激细胞中ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化，阻断MAPK通路。同时还能上调SOD、GSH、Nrf2、HO-1等的表达，并激活Nrf2通路，使两条通路共同发挥作用，缓解氧化应激。结果表明，其能减轻DNA损伤，抑制p65核转位，降低细胞内TNF-α含量，从而保护细胞。

食源性抗氧化肽已成为功能性食品中新的研究方向，具有广阔的前景。从丰富的食品原料和各种加工副产物中提取制备抗氧化肽，安全性高，可操作性强。因此，食品来源的抗氧化肽作为抗氧化剂具有广阔的前景，对其活性和作用方式的深入研究能够为其应用提供更好的理论依据。

翻译整理：李智

校对：解伟

审核：隋丽英

技术编辑：李智

信息监督电话：60601585

受理人：刘老师

文献来源：Renzhi Lv, Yifei Dong, Zhijie Bao, et al. Advances in the activity evaluation and cellular regulation pathways of food-derived antioxidant peptides[J]. Trends in Food Science & Technology, 122(12):171-186. https://doi.org/10.1016/j.tifs.2022.02.026

*\ 声明**