鹿骨胶原蛋白肽的制备工艺优化及其体外抗氧化活性

马俊霞 姜璎珊 张可 冯如意 邢艳超 时坤 杜锐 宗颖

（吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

DOI：10.13326/j.jea.2024.1958

摘 要 为实现鹿骨的高附加值利用，采用发酵-酶解联用技术制备鹿骨胶原蛋白肽。以杂蛋白去除率为指标，采用单因素和响应面试验对鹿骨的发酵工艺进行优化，通过酶解法制备鹿骨胶原蛋白肽，并测定了肽的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、氨基酸组成和体外抗氧化活性。结果表明：鹿骨胶原蛋白肽的最佳发酵工艺条件为发酵时间34.5 h，料液比1∶26，接种量12%。与未发酵鹿骨胶原蛋白肽（NCP）相比，发酵鹿骨胶原蛋白肽（FCP）能够被更好的酶解且具有更多与抗氧化有关的氨基酸。肽对DPPH自由基和ABTS自由基的清除率分别为55.84%和94.11%，IC50值分别为21.57 mg/mL和0.19 mg/mL。肽能够增强抗氧化相关酶的活性，下调丙二醛（MDA）含量，说明其对D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老人皮肤成纤维（HSF）细胞具有抗氧化作用，与NCP相比，FCP具有更强的抗氧化能力。研究结果为鹿骨的深度开发和利用提供了理论基础。

关键词 鹿骨；胶原蛋白肽；发酵；响应面法；抗氧化

鹿骨是鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的骨骼。味甘，微热，无毒，归肾经。首载于《名医别录》，具有补虚祛风，强筋健骨，安胎下气的功能。《本草纲目》记载“鹿骨主补内虚，续绝伤，补骨强筋，除风，久服耐老”。胶原蛋白是鹿骨中的主要结构蛋白，具有特征性三螺旋结构Gly-X-Y，X和Y分别是脯氨酸和羟脯氨酸，将胶原蛋白从鹿骨中提取出来，经过酶解可以得到小分子肽。胶原蛋白肽具有良好的抗氧化、修复皮肤损伤等生物活性，应用于食品中，口服后经胃肠被分解成小分子氨基酸，可以为机体提供合成胶原蛋白的物质基础。Yazaki等通过动物试验发现，口服摄入的胶原蛋白肽在体内的衍生肽（如Gly-Pro-Hyp，Pro-Hyp-Gly和Pro-Hyp等）可以转移到皮肤中。胶原蛋白肽能够通过增加透明质酸酶蛋白质的表达、降低透明质酸酶mRNA的表达来增加皮肤的透明质酸水平，提高皮肤保湿因子丝聚蛋白和内皮蛋白的表达，修复皮肤屏障，增强皮肤的水合作用。胶原蛋白肽具有抗氧化作用，从金枪鱼皮中提取的胶原蛋白肽能够清除DPPH自由基和ABTS自由基。口服胶原蛋白肽与维生素C透皮给药联合治疗能够使无毛Sod 1（-/-）双突变小鼠皮肤中的丙二醛和8-异前列腺素含量降低，说明联合治疗可以抑制小鼠皮肤的脂质过氧化过程，减轻小鼠皮肤的氧化损伤。研究表明，鸡骨胶原蛋白肽能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进胶原合成，并通过抑制MMP-1/3的表达来抑制胶原降解，从而缓解小鼠皮肤老化。胶原蛋白肽还可以抑制脂肪酸和胆固醇的合成，激活β氧化，上调氧化的肝蛋白表达水平，进而显著降低血浆和肝的脂肪水平，抑制胆汁酸的合成，说明胶原蛋白肽能够通过抑制脂肪堆积和调节脂质代谢发挥抗肥胖作用。近年来，基于胶原蛋白肽的营养保健品的开发和研究不断增加，临床研究证实，口服胶原蛋白肽能使受试者皮肤弹性显著增加，改善皮脂分泌和皮肤胶原蛋白的结构。目前，针对鹿源产品的研究主要集中在鹿茸方面，鹿骨的相关文献报道较少，限制了鹿骨的开发和利用。因此，本试验探索从鹿骨中提取鹿骨胶原蛋白肽的最佳工艺并进一步研究其抗氧化作用，为其应用于抗皮肤衰老的口服制剂提供理论依据。

发酵是食品工业中常见的加工技术之一，能够对蛋白质的组成、结构、功能特性以及风味产生影响，从而改善食品的风味和感官品质，提高营养价值并促进人体吸收。乳酸菌是食品发酵最重要的微生物之一，乳酸菌能够在一定条件下利用碳水化合物发酵产生乳酸，革兰氏阳性菌，兼性好氧或微好氧。发酵过程中，乳酸菌会产生蛋白酶，将蛋白质水解成小肽和氨基酸，并进一步脱氨基产生NH3-N，还会产生脂肪酶，分解脂肪，形成有利于人体吸收的低级脂肪酸和必需脂肪酸。益生菌发酵能够提高中药提取物的生理活性，白芷根发酵提取物具有更好的抗络氨酸酶和抗氧化活性；枳实花发酵提取物的抗酪氨酸酶活性、抗氧化活性、抗菌活性、总黄酮含量和抗皱活性分别是未发酵提取物的5.20倍、13.50倍、12.50倍、3.17倍和4.29倍。同时，发酵后的中药提取物还能够抑制与老化相关的酶的活性，如胶原酶、弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）。对动物副产品进行发酵，能够提高其营养价值，获得适合作为食品或化妆品成分的提取物，对罗非鱼皮进行发酵可以去除杂蛋白，从而提取纯度更高的胶原蛋白；采用生物发酵的方式能够对牛骨蛋白肽粉脱臭，从而提高食品风味和营养价值。嗜酸乳杆菌具有能够利用多种碳源、生长速度快、氨基酸营养需求高等特性。本研究利用其对蛋白质和脂肪的代谢能力对鹿骨进行发酵，探索发酵鹿骨的最佳条件，并联合酶解法提取鹿骨胶原蛋白肽。

本试验以鹿骨为研究对象，采用发酵法去除杂蛋白，在单因素试验的基础上，通过响应面法优化最佳发酵工艺；并采用热水抽提法提取鹿骨中的胶原蛋白，分别使用胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解得到鹿骨胶原蛋白肽FT和FP，对未发酵鹿骨进行相同处理得到鹿骨胶原蛋白肽NT和NP。通过测定DPPH自由基和ABTS自由基清除率、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量比较发酵前后制备的鹿骨胶原蛋白肽的氨基酸组成和体外抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹿骨，市售；嗜酸乳杆菌，北纳创联生物科技有限公司；MRS肉汤培养基、DPPH试剂盒、ABTS试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；羟脯氨酸（Hyp）含量检测试剂盒，江苏艾迪生生物科技有限公司；人皮肤成纤维（HSF）细胞，武汉赛奥斯生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、脂质氧化（MDA）检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

三气厌氧培养箱，长沙华曦电子科技有限公司；厌氧培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；CO2培养箱，赛默飞世尔科技公司；全自动氨基酸分析仪，日立高新技术公司。

1.3 方法

1.3.1 鹿骨基本成分测定

购置鹿腿骨，去除多余的肉和筋膜，流水冲洗3次，晾干水分后敲碎成小块。分别参考《GB 5009.3—2016》《GB 5009.4—2016》《GB 5009.5—2016》《GB/T 9695.23—2008》测定鹿骨中水分、灰分、蛋白质、羟脯氨酸的含量。

1.3.2 种子液制备

将嗜酸乳杆菌接种至5 mL MRS肉汤培养基，置于三气厌氧培养箱中，37℃活化24 h。取1 mL活化菌液接种到新的100 mL MRS肉汤培养基中，相同条件复壮36 h，得到种子培养液。将种子培养液8 000 r/min离心8 min，弃掉上层MRS肉汤培养基，得到生长状况良好的嗜酸乳杆菌菌体。用适量无菌水重悬后以相同条件离心，弃掉上清，重复3次，以清洗菌体彻底置换培养基，将菌体用100 mL无菌水重悬，即得发酵种子液。

1.3.3 单因素试验

发酵时间对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响。将鹿骨与无菌水以1∶20（g∶mL）的比例混合，加入体积分数8%的发酵种子液，在37 ℃厌氧条件下分别发酵20，24，28，32，36 h。发酵结束后收集发酵液，测定发酵液中的蛋白和羟脯氨酸含量。

料液比对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响。将鹿骨与无菌水分别以1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g∶mL）的比例混合，加入体积分数8%的发酵种子液，在37 ℃厌氧条件下发酵28 h。发酵结束后收集发酵液，测定发酵液中的蛋白和羟脯氨酸含量。

接种量对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响。将鹿骨与无菌水以1∶20 （g∶mL）的比例混合，分别加入体积分数2%，4%，8%，12%，16%的发酵种子液，在37 ℃厌氧条件下发酵28 h。发酵结束后收集发酵液，测定发酵液中的蛋白和羟脯氨酸含量。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素试验结果，以发酵时间（A）、料液比（B）、接种量（C）为因子，杂蛋白去除率为响应值，利用Design-Expret 13.0软件对发酵条件进行曲面响应试验，得到二元多项式回归方程，进行重复试验。因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平 Table 1 Response surface experiment factor level

1.3.5 检测方法

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒和羟脯氨酸含量检测试剂盒说明书，分别检测发酵液中的蛋白含量和羟脯氨酸含量。

杂蛋白去除率＝［（M1-M2×7.1）/M］×100%，式中，M1为每克鹿骨对应的发酵液中的蛋白含量（mg）；M2为每克鹿骨对应的发酵液中的羟脯氨酸含量（mg）；M为每克鹿骨中的杂蛋白含量（mg）；7.1为羟脯氨酸到胶原蛋白的转化系数。

1.3.6 鹿骨胶原蛋白肽的制备

将发酵好的鹿骨以1∶10 （g∶mL）的料液比进行热水抽提，95 ℃提取3 h，过滤，重复3次，合并滤液后冻干。将冻干后得到的固体溶解至底物浓度为4%，分别用胰蛋白酶和胃蛋白酶进行酶解。酶解条件：6 300 U/g的胰蛋白酶37 ℃酶解4 h，6 200 U/g的胃蛋白酶37 ℃酶解3.2 h；酶解完成后在沸水中煮15 min终止酶解，将得到的酶解液8 000 r/min离心10 min，取上清液冷冻干燥。同时对未发酵的鹿骨进行上述操作。得到4种鹿骨胶原蛋白肽，发酵后经胰蛋白酶酶解的鹿骨胶原蛋白肽（FT）、发酵后经胃蛋白酶酶解的鹿骨胶原蛋白肽（FP）、未发酵的经胰蛋白酶酶解的鹿骨胶原蛋白肽（NT）、未发酵的经胃蛋白酶酶解的鹿骨胶原蛋白肽（NP）。

1.3.7 组成分析

FT-IR。取2 mg样品，加入100 mg干燥KBr于研钵中混合，充分研磨后压片，采用傅里叶变换红外光谱仪在400~4 000 cm-1扫描。

氨基酸组成。取0.02~0.03 g样品，加入50% HCl，于充氮仪上冲入氮气后放入111 ℃烘箱消化22 h。消化后过滤，定容至50 mL，取700 μL过水系滤膜移入小瓶中，使用全自动氨基酸分析仪进行分析。

1.3.8 抗氧化能力测定

DPPH自由基清除能力测定。配制0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液（现配现用，3.5 h内用完），将样品和DPPH溶液加入96孔板，避光孵育30 min，在517 nm波长处检测吸光度。

DPPH自由基清除率＝［1-（A–C）/B］×100%，式中，A为50 μL样品+100 μL DPPH溶液的吸光度；B为50 μL水+100 μL DPPH溶液的吸光度；C为50 μL样品+100 μL无水乙醇溶液的吸光度。

ABTS自由基清除能力测定。配制ABTS溶液：20.4 mg ABTS+5 mL H2O+5 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液，避光反应16 h，用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长处吸光度为0.70±0.05。在96孔板中加入样品和ABTS工作液，避光孵育30 min，在734 nm波长处检测其吸光度。

ABTS自由基清除率＝（1-A/B）×100%，式中，A为80 μL样品+140 μL ABTS溶液的吸光度；B为ABTS溶液的吸光度。

MDA含量，SOD，CAT和GSH-Px的活力测定。将HSF细胞以1×106/mL接种于6孔板中，每孔2.5 mL，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h。设置空白组（NC）、模型组［（40 mg/mL D-半乳糖（D-gal）］以及FT，FP，NT，NP的高、中、低剂量组（根据前期试验，4种提取物的高、中、低剂量分别设置为500，250，125 μg /mL，同时添加造模药物D-gal 40 mg/mL）。分别给药后培养24 h，按照MDA，SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒进行检测。

1.4 数据处理

利用SPSS，GraphPad Prism 8，Design-Expert 13.0，OriginPro 2020等软件进行数据处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 鹿骨基本成分测定

鹿骨中含蛋白质9.95%，羟脯氨酸0.54%，羟脯氨酸是胶原蛋白的特征氨基酸，通过羟脯氨酸含量和羟脯氨酸与蛋白质之间的转化系数7.1，得出鹿骨中含3.83%胶原蛋白和6.12%杂蛋白。另外，鹿骨中含有水分9.63%，灰分63.64%。

2.2 单因素试验

2.2.1 发酵时间对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响

发酵时间是影响菌种去除杂蛋白效果的重要因素，发酵时间应在菌种的对数生长期内，时间过短除杂不充分，时间过长胶原蛋白流失过多。由图1可见，随着时间的延长发酵液中蛋白的含量增加，在发酵32 h时达到最大值（6.45±0.50） mg/g，此时发酵液中的羟脯氨酸含量为（0.17±0.01） mg/g。继续发酵则发酵液中的蛋白含量下降，可能由于随着发酵时间的延长鹿骨中可供菌种利用的营养成分减少，菌种的生长代谢受阻，转化蛋白的能力减弱。发酵32 h时杂蛋白去除率达到最大值（8.58%），选择发酵时间32 h进行后续试验。

图1 发酵时间对鹿骨杂蛋白去除率的影响 Fig. 1 Effect of fermentation time on the removal rate of deer bone heteroproteins

2.2.2 料液比对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响

由图2可见，料液比<1∶25时，菌液过少，菌种对鹿骨中蛋白和脂肪的消耗较少，溶出的蛋白量少，因此发酵液中蛋白和羟脯氨酸含量较低。当料液比为1∶25时，发酵液中蛋白含量最高，为（6.26±0.48） mg/g，羟脯氨酸含量为（0.16±0.03） mg/g。料液比>1∶25时，鹿骨中蛋白和脂肪相比菌液减少，菌体与鹿骨的接触减少，导致其转化蛋白的能力降低。料液比为1∶25时杂蛋白去除率达到最大值（8.43%），选择料液比1∶25进行后续试验。

图2 料液比对鹿骨杂蛋白去除率的影响 Fig. 2 Effect of solid-liquid ratio on the removal rate of deer bone heteroproteins

2.2.3 接种量对鹿骨中杂蛋白去除效果的影响

在发酵过程中接种量决定嗜酸乳杆菌的生长繁殖速度以及消耗脂肪和蛋白的速度，进而影响蛋白溶出量。由图3可见，随着接种量的增加，发酵液中的蛋白含量增加；当接种量为12%时，蛋白溶出量达到最大值，为（5.32±0.13） mg/g，羟脯氨酸含量为（0.23±0.01） mg/g。当接种量>12%时，发酵液中的蛋白含量降低，可能由于发酵体系中的菌体过多，鹿骨的营养物质被大量消耗，并累积了较多代谢废物，导致整体发酵水平较低。接种量为12%时杂蛋白去除率达到最大值（6.03%），选择接种量12%进行后续试验。

图3 接种量对鹿骨杂蛋白去除率的影响 Fig. 3 Effect of inoculation volume on the removal rate of deer bone heteroproteins

2.3 响应面优化

按照表1进行三因素三水平的响应面试验，试验设计和结果见表2。利用Design-Expert 13.0软件对试验设计结果进行多项式回归拟合分析，得到杂蛋白去除率回归方程，杂蛋白去除率=9.31+0.075A+0.36B+0.29C+0.040AB-0.16AC-0.30BC-1.06A2-0.78B2-0.72C2。

表2 响应面试验设计和结果 Table 2 Response surface experimental design and results

回归模型的方差分析结果见表3。回归模型P=0.000 1<0.001，差异极其显著，说明建立的模型有意义，失拟项P=0.436 3>0.05差异不显著，R2=0.971 3，说明所得模型的拟合程度较好，可预测试验结果，而修正判定系数R2Adj=0.934 4与R2Pred=0.764 7的值相差<0.2，说明该响应面设计合理。根据表3中各因素的F值可知，各因素对杂蛋白去除率的影响程度为料液比（B）>接种量（C）>发酵时间（A）。

表3 回归方程方差分析表 Table 3 Analysis of variance （ANOVA） table for regression equations

注：“**”表示差异极其显著（P<0.001），“”表示差异极显著（P<0.01），“”表示差异显著（P<0.05）

图4为3个因素分别两两交互对杂蛋白去除率的影响。在3D响应面图中，曲面越陡峭交互作用对杂蛋白去除率的影响越大。由图4可见，两因素交互作用对杂蛋白去除率的影响程度为料液比和接种量（BC）>发酵时间和接种量（AC）>发酵时间和料液比（AB）。

图4 3D响应面 Fig. 4 3D response surface

2.4 最佳工艺条件

通过拟合模型方程，得到最佳条件为发酵时间34.54 h，料液比1∶26.16，接种量12.32%，杂蛋白去除率8.98%。结合实际操作情况，确定发酵鹿骨的条件为发酵时间34.5 h，料液比1∶26，接种量12%。按照上述条件，进行3次平行验证试验，杂蛋白去除率为（9.01±0.17）%，与模型无显著差异，说明通过响应面法得到的各项反应条件的优化参数可靠、准确。

2.5 组成分析

2.5.1 傅里叶变换红外光谱

由图5可见，在约3 220 cm-1处宽峰为酰胺A带的特征吸收峰，由N—H键和O—H键的拉伸振动产生；在约3 080 cm-1处为多肽（—CONH—）的特征吸收峰，约3 006 cm-1处由—CH2或—CH3的C—H键伸缩振动产生。蛋白质的红外光谱图主要关注3条特征吸收谱带：在约1 648 cm-1处的酰胺Ⅰ带（1 600~1 700 cm-1），由多肽的骨架C

O键伸缩振动产生；在约1 542 cm-1处的酰胺Ⅱ带（1 530~1 550 cm-1），由N—H键和C—N键的弯曲振动产生；以及位于约1 240 cm-1处的酰胺Ⅲ带（1 260~1 300 cm-1），与C—N键的伸缩振动和N—H键的弯曲振动有关。

图5 FT，FP，NT和NP的傅里叶变换红外光谱 Fig. 5 Fourier transform infrared spectroscopy of FT， FP， NT and NP

计算肽4种样品的二级结构可知，肽主要由β-折叠和β-转角组成，含量分别为41%~48%和38%~41%；无规则卷曲和α-螺旋含量较低，分别为6%~9%和6%~8%。经发酵后，FCP的结构由更多紧密有序的α-螺旋转化为较为松散的β-折叠。说明与未发酵鹿骨胶原蛋白肽（NCP）相比，发酵鹿骨胶原蛋白肽（FCP）被更好的酶解为多肽。

2.5.2 氨基酸组成

肽中的主要氨基酸为甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）和天门冬氨酸（Asp），其中甘氨酸和脯氨酸是胶原蛋白中含有的特征氨基酸，说明4种提取物均为胶原蛋白肽。4种样品所含氨基酸的种类没有变化，但FT和FP中Gly，Glu，Ala和Asp的含量略高于NT和NP（图6）。肽的氨基酸组成是影响其抗氧化活性的重要因素，疏水氨基酸Gly，Pro和Ala能够作为供氢体提供环状结构中的羟基，从而清除羟基自由基，帮助肽分子进入疏水的靶器官，抑制氧化损伤；酸性氨基酸Glu和Asp是哺乳动物小肠上皮细胞的重要能量来源，可通过脱羧基或转氨基等作用转化为其他营养物质，在缓解氧化应激方面起重要作用。因此，FCP中含有更多的Gly，Glu，Ala和Asp，说明其抗氧化能力更强。

图6 FT，FP，NT和NP中氨基酸的含量 Fig. 6 Percentage content of amino acids in FT， FP， NT and NP 1.天门冬氨酸；2.苏氨酸；3.丝氨酸；4.谷氨酸；5.甘氨酸；6.丙氨酸；7.缬氨酸；8.蛋氨酸；9.异亮氨酸；10.亮氨酸；11.苯丙氨酸；12.赖氨酸；13.组氨酸；14.精氨酸；15.脯氨酸

2.6 抗氧化能力测定

2.6.1 自由基清除能力测定

4种鹿骨胶原蛋白肽DPPH自由基和ABTS自由基清除能力见图7。维生素C对DPPH自由基和ABTS自由基的清除效果较好。在FT和FP<16 mg/mL时，随着多肽质量浓度的增加，对DPPH自由基的清除率迅速升高，在16 mg/mL后趋于平缓。FT对DPPH自由基的清除率为55.84%，IC50值为21.57 mg/mL；FP对DPPH自由基的清除率为50.95%，IC50值为35.69 mg/mL；NT和NP对DPPH自由基的清除率分别为37.60%和15.54%，FCP对DPPH自由基的清除效果优于NCP。

图7 鹿骨胶原蛋白肽自由基清除能力 Fig. 7 Deer bone collagen peptide free radical scavenging ability

在FT，FP和NT<1 mg/mL时，随着多肽质量浓度的增加，对ABTS自由基的清除率迅速升高，在1 mg/mL后趋于平缓。FT对ABTS自由基的清除率为94.11%，IC50值为0.19 mg/mL；FP对ABTS自由基的清除率为91.00%，IC50值为0.33 mg/mL，NT对ABTS自由基的清除率为90.71%，IC50值为0.25 mg/mL，NP对ABTS自由基的清除率为43.15%，FCP对ABTS自由基的清除效果优于NCP。

2.6.2 MDA含量，SOD，CAT和GSH-Px的活力测定

为探究鹿骨胶原蛋白肽体外抗氧化活性，检测其对D-gal诱导的衰老HSF细胞相关抗氧化指标的影响。由图8可见，与NC组相比，D-gal组HSF细胞的MDA含量极显著上调（P<0.01），细胞脂质过氧化发生；与D-gal组相比，FT的高、中、低剂量组，FP的高、中剂量组和NT的高剂量组均能显著下调细胞中MDA的含量（P<0.05），改善D-gal诱导的HSF细胞的氧化应激。

图8 鹿骨胶原蛋白肽对HSF细胞相关抗氧化指标的影响 Fig. 8 Effect of deer bone collagen peptides on related antioxidant indexes of HSF cells “#”表示与NC组相比差异显著（P<0.05），“##”表示与NC组相比差异极显著（P<0.01）；“”表示与D-gal组相比差异显著（P<0.05），“”表示与D-gal组相比差异极显著（P*<0.01）

由图8可见，与NC组相比，D-gal组HSF细胞的SOD，CAT和GSH-Px活性均极显著降低（P<0.01）；与D-gal组相比，FT和NT的高、中、低剂量组以及FP和NP的高、中剂量组均能显著提高细胞中SOD的活性（P<0.05）。与D-gal组相比，FT，FP，NT和NP的高、中、低剂量组均能极显著提高细胞中CAT的活性（P<0.01）。FT，FP和NT的高、中、低剂量组和NP的高、中剂量组均能显著提高细胞中GSH-Px的活性（P<0.05）。说明鹿骨胶原蛋白肽能够下调细胞中MDA的含量，提高SOD，CAT和GSH-Px的活性，对D-gal诱导的衰老HSF细胞具有抗氧化作用，且FCP的抗氧化作用优于NCP。

3 结论与讨论

发酵条件能够直接影响发酵结果，探索发酵过程的最佳条件至关重要。本研究中，根据单因素和响应面试验结果可知，嗜酸乳杆菌发酵的最佳条件为发酵时间34.5 h，料液比1∶26，接种量12%。可能由于嗜酸乳杆菌在34.5 h时到达稳定期，活菌数最高，但代谢废物积累较少，进而影响菌种的正常生长繁殖，本研究结果与余倩等的研究结果一致，乳酸菌在24~36 h达到稳定生长期，在稳定期乳酸菌的活菌数达到最高且基本保持不变。有研究表明，料液比和接种量与发酵菌种和底物种类有关，最佳发酵条件为接种量4%~12%，料液比1∶5~1∶25，与本研究的结果相符。

发酵处理可以改变部分提取物的含量，促进提取物的活性。研究表明，发酵鹿茸提取物能够提高鹿茸中γ-氨基丁酸和唾液酸的浓度，延长秀丽隐杆线虫的寿命，并通过调节免疫相关因子，如白细胞介素-10、白细胞介素-20、肿瘤坏死因子-α等起到免疫促进作用。此外，发酵鹿茸提取物还能够上调Ⅰ型胶原蛋白mRNA的表达。本研究中，发酵鹿骨提取的胶原蛋白肽比未发酵鹿骨提取的胶原蛋白肽具有更好的体外抗氧化能力。补充胶原蛋白肽能够促进皮肤胶原蛋白的产生，抑制机体的氧化过程，增强皮肤水合能力，修复皮肤屏障，从而改善皮肤衰老问题。发酵鹿骨胶原蛋白肽在抗皮肤衰老中可能发挥的其他作用需进一步探索。

本文通过单因素和响应面试验确定去除鹿骨中杂蛋白的最优发酵条件为发酵时间34.5 h，料液比1∶26，接种量12%。经热水抽提后分别用胰蛋白酶（6 300 U/g，37 ℃酶解4 h）和胃蛋白酶（6 200 U/g，37 ℃酶解3.2 h）酶解，得到鹿骨胶原蛋白肽。对FCP和NCP进行FT-IR及氨基酸组成分析，发现FCP能被更好的酶解且含有更多与抗氧化有关的氨基酸。体外抗氧化能力研究结果表明，鹿骨胶原蛋白肽具有良好的清除自由基能力，通过检测MDA，SOD等指标进一步证明鹿骨胶原蛋白肽能够在体外发挥抗氧化作用，且FCP的体外抗氧化作用优于NCP。

引用本文： 马俊霞，姜璎珊，张可，等.鹿骨胶原蛋白肽的制备工艺优化及其体外抗氧化活性［J］.经济动物学报，2024，28（3）：239-248. (MA Junxia,JIANG Yingshan,ZHANG Ke,et al.Optimization of Preparation Process and Antioxidant Activity of Deer Bone Collagen Peptide in Vitro[J].Journal of Economic Animal,2024,28(03):239-248.)

作者简介： 马俊霞，女，硕士研究生，主要从事动物药理学研究。

通讯作者： 宗颖，E-mail：zongying@jlau.edu.cn

基金信息： 吉林省重大科技专项（20220304001YY）

中图分类号： S825

文章编号： 1007-7448（2024）03-0239-10

文献标识码： A

收稿日期： 2024-07-03

出版日期： 2024-09-25

网刊发布日期： 2024-08-09

经济动物学报

文 字｜马俊霞

初 审｜于   静

复 审｜卢晓雪

终 审｜鞠善宏